鱟試劑測定法，作為藥典如USP<85>章所規(guī)定的關(guān)鍵方法，廣泛應(yīng)用于細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測。盡管其重要性不言而喻，但該方法的測量結(jié)果易受多種分析條件變化的影響，導(dǎo)致LAL（鱟試劑）測定的結(jié)果具有較高的可變性。這種可變性主要源自試劑質(zhì)量、待測產(chǎn)品特性以及檢測方法本身，尤其是在采用光度測定方法（包括顯色法和濁度法）時(shí)更為顯著。因此，本文深入探討了LAL測試變異性的原因，并著重闡述了通過實(shí)施有效的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制措施來評估和減少這種變化的重要性。

一、鱟試劑測試變異性的來源

（一）鱟試劑

鱟試劑作為一種源自生物的復(fù)雜混合物，包含了多種酶和輔助因子，因其非單一純化酶的特性，使得每批裂解物的酶活性難以精確測量。此外，生產(chǎn)過程中引入的緩沖劑和表面活性劑進(jìn)一步加劇了批次間的差異。為了評估每批鱟試劑的酶活性，制造商通常依賴美國藥典的內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品（RSE），但鑒于RSE的稀缺性和高昂成本，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)而使用由鱟試劑供應(yīng)商根據(jù)RSE評估確定的效力的細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE），這一做法無形中增加了測試結(jié)果的變異性。

（二）細(xì)菌內(nèi)毒素

實(shí)驗(yàn)室制備的細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）源自高度純化的大腸桿菌菌株，主要成分為脂多糖并添加了穩(wěn)定填充劑，而環(huán)境內(nèi)毒素則通常以未純化的形式存在，為大分子復(fù)合物，這導(dǎo)致了在利用CSE進(jìn)行測定時(shí)兩者間存在差異。此外，盡管鱟試劑對細(xì)菌內(nèi)毒素具有高度特異性，但它僅能檢測細(xì)菌內(nèi)毒素分子中負(fù)責(zé)激活裂解物的脂質(zhì)A部分。值得注意的是，脂質(zhì)A部分可能形成未充分分散的聚集體，造成檢測不均勻，從而導(dǎo)致樣品中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量被低估。此外，細(xì)菌內(nèi)毒素分子的化學(xué)特性和穩(wěn)定性隨時(shí)間推移而發(fā)生變化，這進(jìn)一步影響了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

（三）鱟試劑檢測法本身的變異性

LAL檢測法的變異性較高，范圍在50%至200%之間。這種變異性主要源于細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率以及多種測試輸入因素的變化，如試管、移液器吸頭、無菌技術(shù)、分析技術(shù)、移液方法差異、控制標(biāo)準(zhǔn)品制備差異、稀釋液配制變化等。此外，長期儲存稀釋液的變化、交叉污染、產(chǎn)品或樣品干擾、取樣容器、樣品儲存時(shí)間和溫度、LAL儀器/模塊變化等也會影響檢測結(jié)果，其中部分問題與檢測技術(shù)人員操作直接相關(guān)。

（四）內(nèi)毒素濃度

標(biāo)準(zhǔn)系列使用的細(xì)菌內(nèi)毒素濃度越小，誤差顯著性越大。例如，1.0至0.1EU/mL的標(biāo)準(zhǔn)曲線與5.0至0.005EU/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列相比，前者在50%至200%的誤差影響范圍內(nèi)更為穩(wěn)定。這也是藥典中測試對照品可接受加標(biāo)回收率為50%至200%的原因之一。

（五）稀釋誤差

測試稀釋尤其是稀釋細(xì)菌內(nèi)毒素和繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)可能出錯。為避免誤差，建議每批細(xì)菌內(nèi)毒素或裂解物常規(guī)使用前應(yīng)由3名技術(shù)人員對稀釋系列鑒定并驗(yàn)證3次。

常規(guī)檢測時(shí)，不同試驗(yàn)稀釋順序應(yīng)一致，且細(xì)菌內(nèi)毒素起始濃度應(yīng)始終保持相同（通常為1000EU/mL），因?yàn)榧?xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線是基于相同的細(xì)菌內(nèi)毒素起始濃度（1000EU/mL）繪制的，這一點(diǎn)可通過查看生產(chǎn)商分析證書或或?qū)Ρ燃?xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（CSE）與美國藥典內(nèi)毒素參考標(biāo)準(zhǔn)品（RSE）來驗(yàn)證。

（六）標(biāo)準(zhǔn)曲線

線性關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線的一致性是鱟試劑檢測的一個(gè)重要特征。線性標(biāo)準(zhǔn)曲線的y軸截距僅發(fā)生1%的變化，就會導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)毒素測定值發(fā)生30%至35%的變化。因此，控制濁度法LAL檢測的變異性時(shí)，需要密切關(guān)注起始（反應(yīng)）時(shí)間。

二、評估差異的方法

盡管可以采取措施來降低變異，但遵循良好質(zhì)量控制的原則，實(shí)驗(yàn)室仍需具備監(jiān)督和評估的手段，以確保檢測結(jié)果的滿意度，并判斷變異是否達(dá)到了值得關(guān)注的程度。其中一種有效的監(jiān)督方法就是審查變異系數(shù)（CV）。

（一）變異系數(shù)（CV）的應(yīng)用

變異系數(shù)是衡量精確度的一個(gè)重要指標(biāo)，以平均值的百分比表示標(biāo)準(zhǔn)差。在鱟試劑檢測中，CV通常表示為測試重復(fù)之間的百分比（%CV），可應(yīng)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)和測試樣品復(fù)制。根據(jù)裂解物供應(yīng)商設(shè)定的要求，常見的精確度要求是CV不超過10%或25%。%CV值越低，意味著不同測試副本之間的精確度越高，結(jié)果越接近。值得注意的是，隨著細(xì)菌內(nèi)毒素濃度的降低，%CV值通常會上升。此外，不同的鱟試劑供應(yīng)商在鱟試劑檢測的驗(yàn)收標(biāo)準(zhǔn)和計(jì)算%CV值的方法上存在差異。

（二）檢測稀釋錯誤

除了變異系數(shù)，稀釋誤差也是評估鱟試劑檢測準(zhǔn)確性的重要方面。為了確保檢測的準(zhǔn)確性，需要檢查標(biāo)準(zhǔn)曲線上細(xì)菌內(nèi)毒素最高濃度的起始反應(yīng)時(shí)間，確保其處于預(yù)期的秒數(shù)范圍內(nèi)，因?yàn)榧词故俏⑿〉钠鹗紩r(shí)間變化也可能顯著影響線性度、斜率和Y-截距，從而對測試結(jié)果產(chǎn)生重大影響。

通過對歷史數(shù)據(jù)進(jìn)行研究，特別是對前-100次使用細(xì)菌內(nèi)毒素的測試進(jìn)行評估，可以確定起始細(xì)菌內(nèi)毒素濃度（如5.0EU/ml）的典型起始時(shí)間范圍。起始時(shí)間是檢測誤差的關(guān)鍵指標(biāo)，因?yàn)樗苯雨P(guān)系到光度法LAL檢測方法的原理，即裂解液與樣品或標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋液中的細(xì)菌內(nèi)毒素反應(yīng)的時(shí)間越快，細(xì)菌內(nèi)毒素濃度越高。

根據(jù)平均值的第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)偏差，可以計(jì)算出起始濃度的光密度達(dá)到所需閾值所需的時(shí)間范圍。鑒于LAL檢驗(yàn)本身存在誤差（通常認(rèn)為誤差為±25%），為了與其他生物檢驗(yàn)方法保持一定程度的標(biāo)準(zhǔn)化，第二個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差可以說是最合適的測量方法。標(biāo)準(zhǔn)差是衡量單個(gè)元素偏離平均值（均值）的程度。其計(jì)算公式為方差的平方根（如圖1所示）。

在LAL檢測中，使用平均值的兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差來界定起始時(shí)間的正常范圍，能確保95%的測試值落在該范圍內(nèi)，超出此范圍的5%則被視為非典型值。每次檢測后，需將最高細(xì)菌內(nèi)毒素濃度點(diǎn)的起始時(shí)間與這一范圍進(jìn)行對比，以驗(yàn)證檢測的合格性。

（三）標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)

每次測試都應(yīng)檢查標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（要求相關(guān)系數(shù)大于或等于0.980），這是藥典要求。標(biāo)準(zhǔn)曲線的一致性很重要，線性標(biāo)準(zhǔn)曲線Y-截距的微小變化會導(dǎo)致細(xì)菌內(nèi)毒素測定結(jié)果大幅變化。

（四）陰性對照

每次檢測都要進(jìn)行陰性對照，陰性對照是構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的水樣，可顯示制備細(xì)菌內(nèi)毒素系列時(shí)是否污染，其細(xì)菌內(nèi)毒素含量必須低于標(biāo)準(zhǔn)曲線中的最-低細(xì)菌內(nèi)毒素濃度（常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)系列為0.05EU/mL），這也是藥典要求。

影響LAL檢測的變異性和測試誤差來源眾多，技術(shù)人員在設(shè)計(jì)檢測方法和調(diào)查檢測異常時(shí)，了解這些因素至關(guān)重要。變異系數(shù)是衡量變異性的關(guān)鍵指標(biāo)，技術(shù)人員審查測試結(jié)果時(shí)需重點(diǎn)檢查，同時(shí)結(jié)合檢測稀釋錯誤、標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)和陰性對照等方面的評估，做好實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制，以確保LAL檢測結(jié)果的可靠性。